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如何解决真假阴性曲线的问题

日期:2022-01-26 14:39:09 来源:中华检验医学网 点击:


作者 | 肖亮博

单位 | 广州开发区医院检验科




前 言


关于《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册(试行第二版)》中对于每批次实验的质量控制,阳性质控品和阴性质控品的要求有明确的说法。



这些质控品的作用,在于监测实验全过程是否达到满意的效果,以及对操作人员所进行操作时的行为监控,避免操作者由于操作污染所造成的假阴性。


做过PCR实验的小伙伴们都知道,操作时不够细心很容易产生污染,更何况是由新手进行PCR实验操作,这些细微操作的要求跟平时进行的其他检验操作是有一定区别的。


这貌似是一个很难避免的过程,毕竟要跟看不见、摸不着的气溶胶打交道,开头总是比较困难的。下面这个例子,正是笔者带着一名踏入PCR行列的同事进行新型冠状病毒核酸检测时所出现的情况,于是整理了以下数据,跟各位同行一起分析交流。


案例经过


当次实验结束准备判断时,发现有两条信号较弱的内标线起跳。如图1


图1


对该批次所有标本进行逐一分析后,得出以下结论:

1. 84号样本内标无反应;

2. 85号样本内标CT值有弱反应:26.98;

3. 第三个生理盐水阴性质控品W3内标CT值有弱反应:28.23;

4. 两个内标弱反应的CT值相差不大,仅1个CT左右;

5. 除W3内标有弱反应外,其余2个生理盐水(W1、W2)、试剂空白(BLK)、第三方弱阳性质控品(QC)(我实验室使用的第三方弱阳性质控品无内标)及试剂附带的阳性对照(P)结果均没问题。


图2 结果有疑惑的曲线图形


图3 质控品结果正常曲线图形


将84号、85号标本重提核酸复查。此次实验过程中的各质控均正常,没有污染的情况出现,但是得到意外的结果:复查后84号标本的内标为正常扩增反应曲线;而85号标本从原来的内标弱反应曲线变成了无内标扩增反应。



图4 结果有疑惑的曲线图形


图5 质控品结果正常曲线图形 


再将85号标本进行提取复查,进行平行双孔的提取及扩增,以确定结果是否与第二批次结果一致;此次实验过程中的各种质控均正常。最终结果显示:85号标本无内标。


图6 复查结果曲线图形


图7 质控品结果正常曲线图形


案例分析


这次实验结果可谓“一波三折”,经过多次实验的确认,分析如下:


一、84号标本结果为阴性是正常标本,第一次实验为何会出现无内标情况?


常见原因可归纳为:1、是否样本采集量不足,2、是否加样量不准确,3、是否加错孔位,4、是否存在反应抑制物,5、是否提取试剂出问题,6、是否扩增试剂配置过久导致探针降解等常见问题。


而对于PCR新手的实验操作,本着临床操作“放手不放眼”的带教前提下,确保操作人员能将样本正确加入相应的提取孔及扩增孔,确保操作过程不会出现漏加和错加。


经过实验回顾和再三的查找分析原因,并结合近期的实验情况,笔者暂把问题的源头指向了提取试剂,因为近期该提取试剂也偶尔出现这种内标无反应的现象,将样本重新提取之后结果就是正常的,然而将其原有的提取液进行点样扩增时仍是无反应。出现这种情况时,首先排除样本的问题及实验操作问题外,应与厂家及时反馈,必要时重新更换另一批次产品。


二、85号标本无内标,通过与临床沟通需要重新采集样本送检。


这种情况通常是细胞采集量不足,核酸采集人员在进行标本拭子采集时可能采集力度或刷取次数不够造成,或者没有采集到,因此在进行标本采集时我们应该严格按照工作手册的要求进行操作[1]


那为什么第一次实验会出现弱内标呢?根据第一次实验的结果我们可以发现85号标本及三号生理盐水对照(W3)所出现的内标结果是极为接近,而生理盐水对照本身是不应该起内标的,弱内标的出现说明实验过程中出现了轻微的污染,这种情况一般考虑为生物安全柜的清洁是否严格执行、样本保存管开盖时是否离提取板过近导致气溶胶的污染、生物安全柜里的分区是否严格执行、PCR加样操作的走位是否严格执行、操作人员的手卫生是否严格执行等等。


进行PCR操作的新手容易造成小污染的一般都是加样操作细节不到位、手套携带污染,这个可能与常规临床检验防控观念有关,常规的检验工作更多的是从标本生物安全危害入手,除了标本离心操作外基本不与气溶胶打交道,而PCR实验讲究的更多是“无基因无核酸”概念[2],因此PCR实验防控观念的改变是实验操作工作的核心。虽然气溶胶是看不见的,但是我们需要在操作中找办法去发现它、解决它。


总 结


尽管分子生物学实验室的工作人员都是需要持证上岗,并经过相关的培训才能进入试验室,但是实验操作并不是纸上谈兵。经验都是实操累积,只有通过动手操作才能遇到并发现更多的问题,从而积累解决问题的经验。我们需要做到从实际出发,理论和经验相结合,坚持做好防疫最重要的防线。不放过、不漏掉任何一个可疑的结果,给自己的工作交出一份满意的答案。




参考文献:

[1]《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册(试行第二版)》

[2]李金明.实时荧光PCR技术[M].第2版.北京:科学出版社,2016.9:237.



END





(责任编辑:labwebx)

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