外周血造血干细胞体外保存的研究现状与进展

　　摘要本文综述了近几年有关外周血造血干细胞体外保存方面的研究进展，讨论了保存温度和冷冻、解冻过程对造血干细胞增殖潜力的影响，细胞因子对冷冻造血干细胞增殖潜力的恢复作用以及低温冻存对造血干细胞免疫活性的影响。

　　关键词：造血干细胞；保存

　　近年来，外周血造血干细胞移植（ peripheral blood stem cell transplantation,PBSCT）在国内外已得到广泛开展，由于 pBSCT比骨髓移植（ bMT）更简便、安全，造血功能恢复快，已成为治疗恶性血液病和多种实体瘤的有效方法。同时，由于在体外保存过程中有效地保证造血干细胞的活力是移植成功的关键，这也使得外周血造因干细胞（ pBSC）的体外保存研究有较快发展。现将近年来有关 pBSC体外保存方面的研究进展作一综述。

　　保存温度和冷冻、解冻过程

　　非冷冻保存 pBSC是最简便的方法，可免去冷冻保存的复杂程序和昂贵的设备，但能否有效地保证 pBSC的活力，一直受到人们的关注。

　　有实验证明[1]，4℃保存造血干细胞24和72小时后，粒细胞巨噬细胞集落形成单位（ cFU-GM）的回收率分别为81%和57%，红系爆式集落形成单位（ burst forming unit-erythroid,BFU-E）为45%和28%。 pettengell等[2]也报道，在4℃时，外周血和骨髓干细胞的 cFU-GM回收率以同样速度下降，24、48和72小时回收率平均为90%、72%和68%，提示造血干细胞可在短期内保存于4℃，有效地支持高剂量化疗。王秀丽等[3]报道，4℃条件下保存的 pBSC，随着保存时间的延 cFU-GM集落数逐渐下降，0小时和24小时保存的干细胞数差异不显著，经过24小时与48、72、96、120小时保存的干细胞数差异有高度显著性。结果提示，在应用动员剂进行 pBSCT的过程中，将第1次采集的 pBSC在4℃保存，2～3天后采集第2次，然后集中输注，同样可以获得移植成功。 ruiz等[4]研究了经粒细胞集落刺激因子（ g-CSF）动员的7例病人的21份 pBSC标本，分别于4℃保存24、48、75乃至96小时等不同时间，在采集24、48、72小时后，干细胞活力仍保持高于90%，在高剂量化疗后给予回输，均获得移植成功。

　　于4℃下保存 pBSC，在短期内特别是48小时内造血干细胞活力无明显下降，现已成为支持高剂量化疗，在短期内进行 pBSCT的简便、经济、可靠、实用的方法，但仍无法长期保存。

　　程控降温、液氮保存干细胞已采用多年，业已证明是保存造血干细胞的有效方法。有人报道[5]，将在液氮中保存的 pBSC在10年后回输给病人进行 pBSC t仍获得移植成功。 humpe[6]报道，外周血中分离的 cD34+造血干/祖细胞，经-196℃液氮保存后， cD34+细胞无明显减少。 farley等[7]也报道， isolex300系统分离的造血干/祖细胞，经冷冻-解冻过程， cD34+细胞活力和 cFU-GM的回收率分别为71%和51.5%，将 cD34+细胞进行第二次冷冻-解冻过程， cD34+细胞仍保持第一次冷冻-解冻后的85.6%活力和72.3%的 cFU-GM回收率。可见，由经过冻存的外周血富集的 cD34+细胞再次冻存及解冻后，细胞的增殖和分化能力改变很小[8]。

　　一般来说，经合适降温过程、在液氮中贮存的细胞，所有酶系统均被抑制，环境中的射线也不会对细胞发生电离损伤，一般可较长期地贮存细胞。

　　由于程控降温、液氮保存设备昂贵、复杂、难以普及，人们一直寻求一种更简便、可靠的冷冻保存方法。 hernandez等[9]报道用6%细胞外冷冻防护剂羟乙基淀粉（ hFS）和5%二甲基亚砚（ dMSO）作为 pBSC的冷冻防护剂，不经程控降温直接在-80℃冰箱中保存。从31例病人采集的 pBSC，用该法保存，回输前测得 cFU-GM和 bFU-E回收率分别为86.6±12.3%和71.8＋14.7%，台盼蓝拒染率＞80%。用该法冻存的外周血干细胞进行移植，全部显示早期植活。 takaue等[10]比较了两组进行 pBSCT的病人，一组12例病人的 pBSC是以5% dMSO和6%HES为防护剂，未经程控降温保存于-80℃冰箱中；另一组12例病人的 pBSC加入10% dMSO防护剂，经程控降温保存于-196℃中。经高剂化疗后进行移植，两组病人粒细胞和血小板的恢复时间无差异，结果提示在保护干细胞增殖潜力等方面，简便的非程控降温保存干细胞同样是有效的。 ratajczak等[11]报道，保存于-80℃的骨髓细胞解冻后比保存于-196℃的骨髓细胞有更高的 cUF-GM和 bFU-E回收率，分别高6%和8%，显示-80℃长期保存可能比-196℃保存有更多优越性。-80℃长期保存 pBSC也有报道， katayama等[12]用-80℃冰箱保存 pBSC，5年后测得 cFU-GM和 bFU-E回收率都在70%以上。

　　在-80℃保存 pBSC时，降温速度和冷冻剂的比例对细胞都有影响。 sputtek等[13]报道，5% dMSO、6% hES和1～5℃/min的降温速度能较好地保存造血细胞，当冷冻速度超过5℃/min， dMSO浓度低于5%（尽管升高 hES浓度）时， cFU的回收率（包括 cFU-GM和 bFU-E）明显下降。总之，除较传统的液氮保存外，-80℃直接冷冻保存造血干细胞逐渐显示其优越性而受到广泛重视和推广。

　　除降温过程会造成细胞损伤以外，解冻过程也可影响到细胞活性。很多研究已证明，合理的解冻方法是快速复温，即在40℃水溶液中解冻，经1～1.5分钟。快速复温可避免重结晶现象的发生，减少细胞破坏。

　　但是最近也不同的报道， katayama等[12]研究发现，在5% dMSO、6% hES 4%ALB的保护剂中冷冻的 pBSC，在室温下降解冻1小时，干细胞活力及 cFU-GM回收率及与快速复温无明显差异。

　　造血细胞的冷冻损伤除发生在冷冻及复温的过程中，复温后的离心洗涤也可因细胞凝聚使部分细胞受损[14]。胡国瑜等[15]研究发现，冷冻保存的脐血单个核细胞复温后，将细胞液与 rhGM-CSF预孵育3小时再进行离心洗涤， cFU-GM、 bFU-E和 cFU-GEMM恢复率明显高于先离心洗涤再孵育以及未经 rh-GM-CSF预孵育的祖细胞恢复率，提示 rhGM-CSF可促使部分受伤细胞恢复其活力。在进行 pBSCT时，解冻后的 pBSC一般不需洗涤和稀释可直接回输，以减少细胞损失。

　　 细胞因子对冷冻的造血干细胞增殖潜力的影响

　　造血干细胞受到冷冻、解冻过程的损伤，活力会有一定程度下降，但在适当条件下，可使造血干细胞活力得到最大程度的保存。除冷冻保护剂和适当的降温速度、复温过程外，目前已发现某些细胞因子对提高冷冻的 pBSC增殖潜力有一定作用。 ratajczak等[16,17]将 cD34+造血干细胞分为二组，分别在冷冻前或刚解冻时加入含有20%小牛血清的培养液中，并加入 kit ligand (KL)、 iL-3和 iL-1共同孵育36小时，结果发现，在冷冻前用细胞因子刺激的 cD34+细胞比解冻后刺激的细胞形成更多的 cFU-GM，同时，两组都比没有经过细胞因子刺激的细胞形成更多的 cFU-GM（ p＜0.05），红系增殖能力也增强。作者认为，在冷冻前用造血生长因子刺激干细胞，能有效地增强冷冻造血干细胞的增殖潜力，这一简便的方法能明显缩短移植后骨髓抑制的时间。另外，部分受冷冻损伤的造血干细胞在一定条件下可恢复其增殖能力。 ratajczak等[18]最近的动物实验进一步发现，将接受致死量放射线照射的 balb/c小鼠进行干细胞移植，把鼠的单个核细胞在冷冻前放入 tPO、 kL、 iL-1α和 iL-3的无血清体系中培养36小时，移植后血小权和粒细胞恢复时间比没有经过培养的快3～5天。在解冻后以同样方法培养36小时再进行移植，也可使造血重建提前3～5天。胡氏等[15]在脐血造血细胞悬液冷冻复温后即加入 rh-GM-CSF预孵育3小时，发现可明显提高人脐血造血细胞集落产率，认为 cM-CSF在刺激各系祖细胞增殖的同时也促进这些细胞的能量合成，这一能量促使受伤细胞恢复活力。

　　 低温冻存对造血干细胞免疫活性的影响

　　在 pBSCT中，足够的免疫造血干细胞是免疫造血功能重建的必须条件。同时，相对分化成熟的定向干细胞，即各细胞系的定向祖细胞，具有短期的一过性免疫造血重建能力，这些细胞的含量对干细胞移植也有非常重要的意义。除免疫造血干细胞和祖细胞，一定类型、含量和功能状态的免疫活性细胞对移植能否成功以及宿主的非特异性感染抵抗力的提高都有重要意义，因此冷冻对免疫造血干细胞及免疫活性细胞的影响越来越受人们的重视。

　　研究表明，冷冻可以影响免疫活性含量及细胞因子的分泌。 venkataraman等[19～23]多次报道，用 lPS诱导的经过冷冻的 mNC培养上清液中，比未经过冷冻的 mNC培养上清液含有明显多量的 iL-1、 iL-2、 iL-6、 iNF－γ和 tNFα。另外，将冷冻的与未经冷冻的 mNC混合培养，产生的细胞因子比预期的要少，提示新鲜的单个核细胞中有抑制细胞因子产生细胞存在。冷冻使抑制性细胞功能降低，因而增加其它类型细胞产生细胞因子。他们认为由于冷冻过程使某些对冷冻敏感的 t淋巴细胞（主要是抑制性 t淋巴细胞即 cD8+细胞）功能不可逆地丧失，而其它亚型的免疫活性细胞功能相对增强，产生大量的白细胞介素和细胞因子。

　　细胞因子的产生增多对移植有重要意义。肿瘤病人在接受大剂量化疗、放疗后，将经过冷冻的 pBSC回输作为干细胞移植，若能增加 iL-1、 iL-2、 iFN-γ和 tNFα等细胞因子的分泌，对增加患者抗感染、抗肿瘤能力都是非常重要的，能有效地降低感染的发生率和肿瘤的复发率。

　　*广东省卫生厅“五个一”工程重点项目

　　参考文献

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