当淋巴细胞细胞亚群分析遇上冷凝集

作者 | 岳竞

指导老师 | 周燕

单位 | 山西白求恩医院

外周血淋巴细胞是维持机体免疫功能的主要细胞，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞等，这些细胞又可分成不同亚群。采用流式细胞术进行淋巴细胞亚群分析，可以监测和评价健康人群免疫功能，也能评估肿瘤患者、自身免疫性疾病和亚健康人群的免疫状态，对疾病的诊断分期、预后评估、疗效评价等均有重要指导意义。在临床工作中，当淋巴细胞亚群遇上冷凝集的标本时，会出现什么情况呢？

2021年11月19日，在日常的淋巴细胞亚群的工作中，在分析一份标本，其异常的流式图引起了笔者的注意：

 图1

图2

如上图所示，图1为正常标本淋巴细胞亚群CD45-FITC/SSC-A双参数散点图，而在图2中，在淋巴细胞群与中性粒细胞群之间，出现一群密集，荧光强度强且有拖尾的细胞群（图2上部圈出部分）。

这群异常的细胞群是什么细胞？是怎么形成的？带着疑问，去寻找原因。在确认当日细胞亚群质控在控，其他患者结果无异常的情况下，查看该患者标本，发现标本在采血管壁上呈现细沙样凝集（见图3）。

图3

莫非这是一份冷凝集标本？随即对该样本进行血常规检测，同时对该样本进行血涂片瑞－姬氏染色。

图4

如图4所示，该标本的MCHC为429g/L。标本红细胞冷凝集判断标准：平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）超过参考上限20g/L^[1］，排除标本脂血，溶血，及球形红细胞等情况，并且肉眼观察有红细胞凝集的现象。且该标本血涂片用低倍镜及高倍镜观察，可见RBC凝集成团块状；血涂片瑞－姬氏染色油镜观察，可见成熟RBC凝集成不规则的片状或团块状。由此可判断，该标本为一冷凝集标本。

查看该患者病历：患者，男，75岁，主因“双手指、鼻尖、耳廓麻木、变紫9月,加重1月”经门诊入院。10月底天气转凉后自觉双手指、鼻尖、耳廓麻木、变紫加重,保暖后可恢复正常,肢端麻木缓解不明显,伴尿色加深及泡沫尿。

生化：白蛋白37,4g/L↓,乳酸脱氢酶507.4IU/L↑，钾3.34mmol/L ↓，血脂、空腹血糖正常；甲功、凝血功能正常；免疫球蛋白定量测定:免疫球蛋白M 2.37g/L↑，补体C30.51g/ L ↓，补体C40.02g/L↓, IgG 、IgA正常；溶血检查:直接抗人球蛋白C3d（士），蔗糖溶血试验、直接抗人球蛋白IgG（-）。临床诊断：冷凝集素综合征可能，溶血性贫血(轻度)。

在确定该标本淋巴细胞亚群CD45-FITC/SSC-A双参数散点图的异常是由于冷凝集造成的干扰，那么如何去除干扰？参考血常规对冷凝集标本的处理方法^[2］:常用的方法有水浴法及血浆置换法。结合淋巴细胞亚群的操作方法，现将该标本分成三份分别进行如下三种处理：

1.血浆置换法：将该标本3000ｒ/ｍin离心５min后分离血浆，吸弃血浆，保留全部白细胞和血小板层，加入等量生理盐水，振荡混匀，重复上述操作3次后，严格按照仪器和试剂盒说明书进行标本的前处理及检测；（图5）

图5

2.37℃水浴法：将冷凝集标本水浴箱温浴30min后，其前处理方法同其他标本一样在室温进行，随后上机进行检测；（图6）

图6

3.37℃全程水浴法：将冷凝集标本水浴箱温浴30min后，整个前处理过程都在37℃水浴箱内进行，随后上机进行检测。（图7）

图7

如图5及图6所示，在经过血浆置换及或37℃水浴加样后室温进行前处理两种处理方法后，两种细胞亚群的CD45-FITC/SSC-A双参数散点图并未改善，异常细胞群依旧存在。

而图7显示：整个前处理过程都在37℃水浴箱内进行这种处理方式，异常细胞群消失，冷凝集干扰得到有效处理。为证实在37℃水浴箱内进行前处理过程不会影响实验过程。在进行处理时用同样的方法将淋巴细胞亚群质控样本进行相同的处理。最终质控在控，说明在37℃水浴箱内进行前处理不会影响最终的淋巴细胞亚群结果。

在该CD45-FITC/SSC-A双参数散点图上设门圈出淋巴细胞群，随即对淋巴细胞群进行分析，表一为不同处理方法处理后该标本淋巴细胞亚群的结果：

表一

最终结果按照37℃全程水浴处理后的检测结果回报临床。分析原因：为什么冷凝集现象会影响淋巴细胞亚群的检测？

我室淋巴细胞亚群的检测设备为DxFLEX流式细胞仪，检测试剂：淋巴细胞亚群检测试剂盒（BECKMANCOULTER原装）。检测原理为四色直接免疫荧光法。四色荧光单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血后，加入荧光计数微球（FLOWCOUNT)由流式细胞仪对淋巴细胞设门，进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数和绝对数。

而冷凝集不仅影响RBC，对淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞等白细胞也会产生凝集作用^[3]。分析异常细胞群的产生：可能为冷凝集致细胞或计数微球分不开，在CD45-FITC/SSC-A双参数散点图上形成一群密集，荧光强度强且有拖尾的细胞群。

发生冷凝集，血常规标本37℃水浴法处理后可正常检测，结果准确，但淋巴细胞亚群标本用37℃水浴法加样后室温进行前处理，CD45-FITC/SSC-A双参数散点图并未改善，推测可能是两者检测过程不一样导致。

血常规是温浴完成立即上机检测，检测时间短，标本不会很快产生冷凝集现象；流式细胞仪检测淋巴细胞亚群需30ｍin进行前处理，标本又会产生冷凝集现象，所以37℃水浴法加样后室温进行前处理不适合冷凝集淋巴细胞亚群检测^[4］。而冷凝集素是引起标本冷凝集的主要原因，理论上将血浆中冷凝集素清除，标本即不会发生冷凝集，但实际效果不理想。只有前处理所有流程在37℃水浴中进行，冷凝集干扰得到了有效的处理。

冷凝集素综合征是由于自身反应性红细胞凝集和外界温度降低等诱导因素导致的以慢性溶血性贫血及微循环栓塞为特征的一组疾病。大多数人血清中都存在冷凝集素，其效价较低，一般不会引起自身红细胞的凝集。但在某些病理（如自身免疫性溶血性贫血、多发性骨髓瘤及支原体肺炎等）情况下，冷凝集素效价可异常增高。含有较高效价冷凝集素的血液离体后温度降低，冷凝集素与红细胞抗原相结合，使红细胞自身发生凝集，但这种凝集是可逆的，当温度升高至一定程度后，凝集的红细胞可自动解聚。

淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。

当淋巴细胞亚群检测遇到冷凝集标本，对标本前处理进行全程37℃水浴可对干扰进行有效处理。同时在本案例中，笔者也认识到在检验过程中，对同一干扰在不同检测项目的处理中，处理方法不能一味照搬，要根据不同项目的检测原理与方法选择合适的处理方法，有效去除干扰，为临床提供正确有效的检验报告。

【参考文献】

［1］中华医学会检验分会全国血液学复检专家组.全国血液学复检专家小组工作会议纪要暨血细胞自动计数复检标准释义[J].中华检验医学杂志，2007，30（4）：380.

［2］郭学霖,赵嘉宁,王茂繁.冷凝集对血常规检测结果的影响及处理措施[J].国际检验医学杂志,2015,21:3202-3203.

［3］张志红．严重冷凝集标本对血常规检测结果的影响分析［Ｊ］．山西医药杂志，2018，47（16）：1956－1958．

［4］赵云平,徐宏忍,潘永圣,郭杰,尹利民.冷凝集致淋巴细胞亚群检测困难1例[J].河北北方学院学报(自然科学版),2021,08:35.

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