准确计数血小板方法学研究进展

                              南京军区福州总医院全军医学检验中心  朱忠勇

    近年来，准确计数外周血中的血小板，已成为血液学和检验医学界的热门话题，其原因有二：一是临床上需要输血小板者日益增多，仅在美国，每年输血小板就达700多万单位以上。由于输注血小板价格高昂，且易发生免疫性输血反应和存在感染的风险，故英、美等国，近年来纷纷提出降低输血小板的起点（triggerpoint）或门（threshold），由过去的20×10⁹ /L降至10×10⁹ /L，甚至5×10⁹ /L，因此迫切要求准确计数血小板。二是迄今为止，所有计数血小板的方法，对于血小板减少的标本，其准确性都比较差，亟需研究改进。
    准确计数血小板实非易事。血小板体积小、无色、易粘附。当血液自血管破损处流出时，血小板一经与破损的血管内皮细胞及组织成分接触，立即以极快的速度粘附于破损的血管壁。因此，无论用何种方法采血，所数得血小板数，均较血中实际血小板数为低，皮肤穿刺采血比静脉穿刺更低。此外，血小板易发生聚集，通常我们在血涂片或骨髓涂片上所见到的血小板，很多是几个聚集在一起的，制片耽搁时间越长，聚集越多。更重要的是，目前所有的血小板计数方法，都存在不少缺陷。
    世界卫生组织（WHO）推荐的血小计数方法，有人称它为国际参考方（下称参考方），是用Ig/dl的草酸铵溶液作溶血-稀释剂，在相差显微镜下，用血细胞计数板肉眼计数。和一切手工计数法一样，该法除了细胞在计数板上散布的天然误差之外，最大的缺点是计数的血小板太少。例如，一个重度血小板减少的患者，如果血小板计数为10×10⁹ /L，实际上在镜下只数到10个血小板，复性很差。据Harrison称，这一方法在不同的操作者之间的变异系统（CV）可达10%-25%。自动化的血液分析仪，无论是阻抗法还是光散射法，对于血小板数及形态正常的标本，结果一般比较可靠，但对于血小板明显减少和/或形态异常者，所得结果误差甚大，有时甚至难以计数。其原因是：这些方法基本上都是依据细胞的近似血小板的所谓“非血小板颗粒”（nonplatelet particles,简称NPPs），如小红细胞、红细胞碎片、白细胞碎片、细菌和真菌以及免疫复合物等，会被当作血小板加以计数，从而使血小板数假性增多。Hammerstrom在一例急性髓细胞白血病（M5型）合并DIC患者的外周血片中，发现大量大小近似血小板的小体。经用细胞化学染色、免疫组化染色等多种方法鉴别，发现其中约1/3与白细胞反应相同；继用抗血小板抗体作免疫组化染色，仅4%呈阳性。证明这种物体，大多数是白细胞或红细胞碎片而非血小板。另一方面，正常人血小板体积相差甚大，可自2fL至 20fL以上。其体积分布直方图不是对称的，而是明显地向右延伸，即都存在一定数量的大血小板。在病理情况下，如原发性血小板减少性紫癜、急性心肌梗塞、糖尿病等，大血小板会增多。由于大部分血液分析仪不能将大血小板与小红细胞等分开（只能提示可能有大血小板存在），致使许多大血小板被当作红细胞而未计入血小板总数中，从而使血小板计数结果偏低。
    由此可见，要想在日常用的血液分析仪上，用一般方法，达到准确计数血小板是不可能的，必须另辟蹊径。
    目前已报道的准确计数血小板的方法，大体上有两大类。一是免疫学方法，即用荧光标记的抗血小板抗体，特异地着染血小板，在流式细胞仪（FMC）或特定的血液分析仪上计数血小板。二是用二维激光散射（two-dimensinal laser light scatter）测定法，将血小板与NPPs分开，达到准确计数，现分述于下。
    1.免疫学测定法
    本法早在1988年即由Aulter提出，但最近几年才深入研究并见诸实用。Dickerhoff(1995)和Matzdorff(1998)应用荧光标记抗血小板膜糖蛋白抗体，用FCM法计数血小板；Davis(1999),Gill(2000)和Harrison(2000)等进一步完善了这一方法。所用的单抗，早期是抗CD41或CD42b，近来多用抗CD61，三种单抗效果相同。FCM方法都比较复杂，一般是先在流式细胞仪上计数着染荧光的血小板和计数红细胞，先求出血小板/红细胞之比值（下称血小板比率），再用普通血液分析仪计数同一患者的红细胞数。然后以血小板比率×红细胞数=血小板数。Dickerhoff则改用已知其浓度的荧光微球代替红细胞，先求出血小板/荧光微球之比值，再乘以荧光微球的浓度，即得到血小板数。上述方法都比较麻烦，荧光微球价格高昂，难以在常规作中推广使用。为此，Gill等改在Abbott公司的CELL-DYN4000型血液分析仪上，直接计数着荧光的血小板，完全省去FCM法要先求血小板比率的步骤。由于用的是现成的仪器，而一般的血液分析仪，都已有一套成熟的操作、校准和质控系统，故计数结果比较准确，可用于常规工作。
    2.二维激光散射法
    本法是最近几年由Bayer公司研制的Advia 120型血液分析仪首先推出的。其设计原理是：根据同质性球体光散射的Mie理论（Mie theory of light scatter for homogenenous spheres）,当球形化的血小板一个一个地通过激光照射区时，在两个角度进行测定：高角度（5°-15°）主要测细胞折射指数（refractive index,简称RI），它与细胞的密度有关：低角度（2°-3°），主要是测细胞的大小。血小的体积在1-30fL,RI在1.35-1.40之间。由于红细胞含有高浓度的血红蛋白，其折射指数高（Ri可达1.44），故大血小板虽然可能与小红细胞、红细胞碎片、红细胞残骸（ghost）以及其它细胞碎片的体积相似，但因为容物不同，RI相差较大，因二维散图上可区别并分别计数。此法无需荧光标记的抗体。也没有繁琐的预处理步骤，可以随常规工作与其它血细胞计数同进进行，使用十分方便。我们已应用于实际工作中，效果甚好。
    3.对两类方法的评价
    关于上述两种方法的准确性，各有关作者均作过详细的实验对比和评价。Harrison等分析了血小板数在4-794×10⁹ /L的87份标本，用FCM（下称免疫学法）计数并与参考（手工）方法和二维激光散射法（用Advia 120型仪器），以及以为基础的Coulter公司的STKS型和GenS型仪器、Sysmex公司的SE 9500型仪器等作了对比，结果血小板数>100×10⁹ /L的标本，免疫方法与参考方法和各类均有很好的相关性，相关系数r2=0.98-0.99;但血小板数<100×10⁹ /L的标本，免疫学方法与三种的相关系数r=0.87，0.90和0.91，而与Advia 120型仪的相关系数r仍达0.96。表明在血小板减少的标本，免疫学方法与二维激光散射法有较高的一致性，而与阻抗法相差较大。该作者遇见一份重度的脂血症标本，用三种阻抗法计数，血小板分别为135、103和193×10⁹ /L，而用免疫法计数，仅为43×10⁹ /L，用Advia 120法为59×10⁹ /L。Gill等在CELL-DYN4000仪器上，以抗 CD61荧光标记法计数血小板，并与一般的光散射法和阻抗法对手工参考方法进行了比较，结果荧光单抗法与参考方法的相关系数r=0.97，光散射法与参考方法的相关系数r=0.94,阻抗法与参考方法的相关系数r=0.85。在精密度方面，也显示免疫法的优越性，见表1。
                    表1  三种方法计数血小板的精密度比较（以CV%表示）

    Kunicka等对二维激光散射法计数血小板的准确性，也进行了详细的比较和评价。Kunicka等将260份血小板在2-1000×10⁹ /L的血样标本将本法与手工参考方法比较（手工法是由二名有经验的技师各计数一块血细胞计数板的两个计数室，以总平均数报告），其相关系数r=0.975；而与 一维法（即和一般 的光散射法）的相关系数r=0.886。值得指出的是，在重度贫血、白血病、MDS、DIC和各种血小板减少的病例，经常出现NPPs，手工法和各种一维法计数结果往往偏高。Kunicka等出了100份血小板低于50×109/L的血样，将二维法与手工法进行比较，结果相关系数r=0.833，远低于血小板数正常的标本。Chapman等用Advia 120 的二维仪器计数血小板，认为它有很高的准确性，可减少65%的人工复查率（review rate ）,从而节省了可观的经费。
    除了各种非血小板颗粒的存在，使血小板计数偏高以外，大血小板和血小板聚集（clump）的存在，是导致阻抗法和一般光学法计数偏 低的主要原因。它们往往因为体积过大而被当作红（白）细胞加以计数。在染色的血涂片上，一般正常血小板的直径在1-4m，Gill等将血涂片上的大型血小板，分为大血小板（macrolpatelet,直径4-6m）和巨血小板（giantplatelet,直径6m以上）两类，在Advia 120仪上，将体积在20fL以上者，定为大血小板，并报告其数量。关于大血小板的参考值及临床义，目前报道尚少，值得进一步研究。
    4   存在的问题
    4.1  尽管免疫法和二维法有很多优点，但还不能说已尽善 尽美。
    免疫法  无论是FCM还是用CELL-DYN仪计数，都要用昂贵的荧光标记单抗和高档的仪器，以及较繁琐的前处理，故仅适用于特殊的病例或用于方法和校准仪器，难以在常规工作中普遍推广。此外，有些血小板膜糖蛋白先天缺陷的患者（如Glanzmann 血小板无力症），因膜上不表达CD61等抗原，就不能用免疫法计数。
    4.2  二维法  尽管它不需特殊试剂和仪器，对NPPs特别是对大血小板的分辨力强，但对白细胞碎片与血小板的鉴别能力如何，尚研究不够。这些碎片，大小可能与血小板相似，但折射率是否像红细胞样有区别还不太清楚。此外，本法区分聚集的血小板的能力，显然不及免疫法。由于血小板聚集过程需要钙离子，因此用除钙的抗凝剂抗凝分混匀血液（和制血涂片），一般不会出现血小板聚集。但应注意有极少数的人的血小板，在用EDTA抗凝时，反充会出现聚集。这种依赖EDTA的血小板聚集现象，有人称其为“EDTA聚集者（EDTA Clumper）”,此时只能换用非EDTA抗凝剂（如枸橼酸钠）进行计数。通常所谓的血小板聚集，是指血小板与血小板之间互相粘附，此时一般血液分析仪会将其误认作红、白细胞而加以计数，导致血小板计数偏低。另有一种现象是血小板粘附于白细胞上，称为”血小板卫星现象（platelet satellitism）”,亦会使血小板假性偏低。
    间接法  目前用于评价血小板计数准确性的“参考方法”是手工法，其本身不但精密度较差，而且在镜下也往往难以准确辨别血小板与某些NPPs，准确性也不够高，但又没有可代替的更好的方法。为了验证和比较各种方法的准确性，Kunicka等提出，增加一项在血涂片上间接计数血小板的方法作为补充。该法是用抗凝血液推一血片，经氏染色后，在厚薄适中处计数1000个红细胞并同时计数所见到的血小板，求得血小板/红细胞之比值。再将此比值×红细胞数（通过一般血液分析仪数得），求得血小板数。此法虽不十分精确，但可以从另一侧面，直观地“间接”计数血小板，还可观察血小板的大小、形态、有无聚集及聚集体大小等等，是一种简单、易行的方法。

　　　　　　　　　　　　　　　摘自《国外医学临床生物化学与检验学分册》2002年23卷第3期