探究药物对APTT基础检测的影响

Amy Carpenter Aquino       正在进行的研究表明Emicizumab(艾米珠单抗)治疗A型血友病的优点-出血次数更少，两次治疗之间的持续时间更长，但实验室需要警惕该药物对凝血测试的影响。     医学博士安德鲁•J•古德温（Andrew J. Goodwin）在十月的CAP20会议上说：“如果你从这个报告中得出任何结论，那么在使用Emicizumab(艾米珠单抗)患者进行的APTT测定是不准确的。停药后，这种药物对基于APTT的检测结果的影响可以持续6个月。”     佛蒙特大学医学中心临床病理科主任兼CLIA主任古德温博士说：“这带来了一种干扰，这是真正的挑战。” 他的共同主讲人是加州大学戴维斯分校医学中心输血服务副医学总监David Unold，医学博士。     Unold博士报告了最近的HAVEN研究艾米珠单抗（Hemlibra，Genentech）的结果，艾米珠单抗是一种双特异性IXa因子和X因子定向抗体，可模拟VIII因子的活性。他说，艾米珠单抗不同于VIII因子替代疗法，因为它实际上结合了前体酶原和活性形式的IX和X因子。它仅结合人类形式的因子IX和X，这对实验室检测有重要意义。     Unold博士说：“关于此事的好处是，尽管治疗方案会根据不同的药物浓度而有所不同，但您最多可以每四周服用一次该药物。” 该药物的半衰期为30天（MüllerJ等人，Thromb Haemost。2019 ; 119 [9]：1384–1393）。     最新的艾米珠单抗试验HAVEN 4研究了12岁及以上的有或没有抑制剂的血友病A患者。Unold博士说：“从本质上说，他们想看看注射间隔时间的延长会带来怎样的试验结果。” 该试验发现，治疗出血的年化率为2.4，虽然比早期HAVEN 3试验中发现的1.5和1.3的出血率略高，但仍显示出注射间隔时间更长的益处。他说：“没有发现具有中和潜力的血栓形成事件或抗药抗体，”（Pipe SW等人，《柳叶刀》 Haematol。2019 ; 6 [6]：e295-e305）。     A型血友病，是促凝血因子VIII的遗传缺陷，是一种对继发性止血产生负面影响的疾病，在这种疾病中，PT正常，APTT延长，并且50:50混合研究（孵育或未孵育）“将纠正到正常范围内或实验室通常使用的任何标准内。”古德温博士说。并且纤维蛋白原和PFA-100结果将是正常的。     古德温博士说：“对于患有狼疮凝血症（后天性血栓形成疾病）的患者，取决于试剂，APTT也可以延长。” “但是区别在于50:50的混合比例无法纠正。因此，如果您是参考实验室或没有任何历史或信息的实验室，则50:50混合比例具有很好的区分信息，可以使用结果。如果长时间进行筛查凝血试验，则50:50的混合比例始终是非常好的。”     他补充说，对于狼疮性凝血病患者，纤维蛋白原和PFA-100是正常的。     在诸如血管性血友病等原发性止血疾病的患者中，PT和APTT可能正常。Goodwin博士说，取决于疾病的严重程度和患者所拥有的血管性血友病的类型，APTT也可以延长。     由于PT，APTT，50：50混合液和纤维蛋白原的测试结果看起来与血友病患者的相似，“当然，对于患有血管性血友病的患者，我们也必须进行血管性血友病研究。”     古德温博士说，对于患有纤维蛋白凝块交联或导致溶血病的纤维蛋白溶解缺陷的患者，筛查测试的敏感性有限。“他们的目的不是要接待患有第XIII因子缺乏症的患者。因此，对于手术后出血延迟或明显出血的患者（通常是几天后，当他们的筛查凝血试验都正常时），该开始考虑纤维蛋白溶解缺陷了。”     对于血友病的专门凝血测试，“主要有两种因子VIII活性监测方法”（基于APTT的凝血和生色底物测定法），根据方法和活化剂的不同，值也存在差异。     “对于血友病，尤其是轻度血友病患者，您的APTT结果可以正常。对于患有继发性止血病且患有甲型血友病的表现或出血性疾病的男性患者，如果基于凝块的活性正常，建议您考虑称为血友病差异的现象，并进行后续检查显色FVIII活性测定。”     他说，显色底物测定法“对遇到的某些突变更敏感，这有助于我们治疗再次出现出血性疾病的患者，我们强烈怀疑这些患者的血块基础因子VIII活性正常。” 显色法与基于凝块的测定相比，该显色测定将具有更高的灵敏度并显示出较低的VIII因子活性。     古德温博士说，今年早些时候发表的一篇论文表明，在某些情况下，“血块的基础活性和显色活性之间的差异可能是2到4甚至6倍的差异。”血块基础活性结果比显色活性结果高（Al-Huniti A等人，Am J Clin Pathol。2020; 154 [1]：78-87）。    

Adamkewicz JI，Chen DC，Paz-Priel I.等 艾米珠单抗（一种模拟活化因子VIII辅助因子功能的人源化双特异性抗体）对凝血测定的影响和干扰。   Thromb Haemost.2019; 119：   1084-1093。   MüllerJ，Pekrul I，PötzschB，Berning B，Oldenburg J，Spannagl M. 等艾米单抗治疗急性血友病的临床研究进展[J] .中华血液病杂志，2019;2019; 119：1384–1393。   Jenkins PV，Bowyer A，Burgess C等。实验室凝血测试和艾米单抗治疗是英国血友病中心医生组织的指南。Haemophilia. 2020; 26：151-155。     古德温博士说，延长半衰期替代品对凝血测试的影响是值得注意的。     “重要的是，当你看这些论文的时候，他们通常会给出接受延长半衰期产品的患者VIII因子的回收率。您需要注意的关键成分是什么试剂，测定类型和使用的活化剂。在这些延长的半衰期产品中，活化剂的行为有所不同”（Van den Bossche D等人，Int J Lab Hematol。2018 ；40 [suppl 1]：21-29）。     例如，Van den Bossche及其合作者发现，APTT-SP试剂（一种采用二氧化硅活化剂的一步凝结测定法）低估了Afstyla（CSL Behring）（单链B结构域）的VIII因子预期回收率。截短的延长的半衰期药物-与显色测定结果相比，减少了大约一半（52％）。如产品说明书中所示，使用校正因子2得出的百分比回收率值为104。“这不是活性百分比，” 古德温博士指出。     “作为实验室，我们需要与临床医生沟通，并了解治疗患者血友病A的特定药物，这样我们就可以确定，在进行基于血凝块测定的化验的患者中，适当的转换因子正在被使用。”古德温博士说。     在Van den Bossche的研究中，显色底物测定法在正常水平下显示出更好的“ FVIII：C预期回收率（％）”，使其成为该药物在制造商中偏爱的检测类型。     但是，当研究低水平的VIII因子（定义可能有所不同）时，“其中一些检测方法的效果很好，” Goodwin博士说。相同的APTT-SP测定法确实回收了约100％的低水平的VIII因子（不使用校正），而显色测定法回收率结果较高，约为150％。     古德温博士解释说，在基于APTT的因子活性测定中，第一种非因子替代药物艾米珠单抗对常见凝血测定的影响显而易见。他指出了最近发表的三篇评论（Adamkewicz JI等人，Thromb Haemost.2019 ; 119 [7]：1084-1093;MüllerJ等人，Thromb Haemost.2019 ; 119 [9]：1384–1393;和Jenkins PV等，Haemophilia， 2020;26[1]:151–155）。     在使用人源性试剂的显色FVIII活性测定中，艾米珠单抗的作用是显而易见的，并导致高估了患者的FVIII活性。因此，实验室需要认识到这一点，并使用对源自艾米珠单抗不敏感的牛衍生试剂（使用牛FIXa和FX成分）进行显色FVIII活性测定。     艾米珠单抗不影响某些凝血和显色测定，例如纤维蛋白原，凝血酶时间，基于PT的APC抵抗力，抗Xa，蛋白C活性（显色法），抗凝血酶活性和纤溶酶原活性。古德温博士说：“当然，基于ELISA的测定法，我们用于von Willebrand's和其他产品的乳胶免疫比浊法测定法不会受到艾米珠单抗的影响，显然，基因检测也不会受到影响。”     他解释了艾米珠单抗为什么会特别影响基于APTT血块的检测分析。“比方说，我们正在监测患者的VIII因子活动水平。我们将采集样品，将添加缺乏VIII因子的血浆，并添加我们的活化剂（含磷脂和钙源）。我们将做一个APTT，记录凝血时间，并且我们将了解APTT与患者凝血因子VIII的浓度成反比。” 如果APTT延长，则因子VIII低。如果太短，则VIII因子活性更高。     由于艾米珠单抗会导致APTT缩短，因此“难怪您会高估患者的VIII因子活性。”     他说，使用人类试剂的显色因子VIII活性测定对艾米珠单抗的存在很敏感，“特别是在美国，它可以作为对艾米珠单抗活性的定性评估，” —是否存在艾米珠单抗？由于因子替代疗法或患者自身的内源性VIII因子，使用牛试剂的生色VIII因子活性分析可定量评估患者样品中的VIII因子活性。“如果要进行贝塞斯达分析以寻找患者体内潜在的抑制剂，则可以使用这种方法。”     显色测定的工作原理是：向使用磷脂和钙的患者样品中过量添加被灭活的活化因子IX，活化凝血酶和凝血因子X。“患者将根据其拥有的VIII因子的多少而与IX因子结合并激活X因子，因此该试验的第一阶段将产生Xa因子。”     他补充说，限制因素是患者拥有多少因子VIII。     “然后，我们取出该患者的血浆，该血浆现在已经激活了X，并添加了显色底物。处于活化形式的因子X将裂解发色底物并产生显色信号，然后可以在405纳米处对其进行测量。在这种情况下，在405纳米处测量的信号量与患者在第一阶段样本中所拥有的VIII因子的量成正比。”     古德温博士说，该试剂是人还是牛是要记住的关键点。前者对艾米珠单抗的存在敏感，而后者则不敏感。因此，在以剂量依赖性方式使用显色测定中，基于艾米珠单抗的浓度，人试剂将显示出增加的因子VIII活性。使用牛试剂，“唯一能够检测到的VIII因子活性就是患者能够对测定系统做出的贡献”（Adamkewicz JI等人，Thromb Haemost。2019 ; 119 [7]：1084–1093 ）。     Unold和Goodwin博士用基于案例的假设场景完成了CAP20演示，以帮助巩固所提供的信息。对于1号病例，要求参与者选择对A型血友病患者最一致的发现：     14岁的女性，月经量大，频繁发作，PT正常，APTT延长，血小板减少。     17岁男性，易瘀伤，频繁关节脱位，右膝关节疼痛，PT、APTT和VWF检测正常，可见血管系统。     45岁的一名男子在结肠切除术后24小时开始从手术部位有渗出液，PT和APTT正常，并且在粘弹性试验中溶解增加。     一个两岁的男孩，其伸肌和非伸肌表面都有多处瘀伤，而且下床后两天膝盖肿胀，PT正常，APTT延长，在即刻和50:50 APTT孵育后完全纠正混合研究。     一名34岁女性，有四胎流产，右下肢当前水肿，PT正常，APTT延长，APTT 50:50即时混合研究未能纠正。     正确的答案是第四个，两岁的男孩。Unold博士解释说，由于A型血友病主要影响男性，尽管女性可能是携带者，但14岁女性患者的情况与血管性血友病更为一致。患者的APTT延长可能是由于VIII因子降低所致，因为它与血管性血友病有关。     这位34岁的女性患者的流产史引发了对血栓形成和潜在的抗磷脂抗体的想法，而她水肿的下肢很可能代表了DVT。他说：“混合失败也将表明潜在的抗磷脂抗体，本质上是抑制剂，而不是一种因子缺陷。”     两名老年男性患者的正常APTT降低了他们诊断为血友病A的可能性。对于这名17岁的男性，Unold博士说：“当然，这种容易出现瘀伤和关节脱位的临床表现，你会在结缔组织疾病的患者中看到，也许是Ehlers-Danlos综合征。” 这位45岁的男子从手术部位有渗出并且在粘弹性测定（例如TEG或ROTEM）上溶解增加，“使我们想到了纤维蛋白溶解，某些患者有时可能在术后发生纤维蛋白溶解，可能是由于纤溶酶原激活物抑制剂减少。但这与A型血友病不一致。” Unold博士说。     他将两岁的孩子称为“ A型血友病典型患者”。     您有一个年轻的病人正在出现新的出血或瘀伤。他的膝盖关节肿胀，是血友病患者出血的典型目标。混合研究的纠正使我们知道我们正在处理一个因子缺乏症，在这种情况下就是因子VIII。”     古德温博士说，该患者被发现在F8基因上具有内含子22倒位。他开始接受标准疗法，但三年后未显示出适当的疗法反应。贝塞斯达（Bethesda）分析显示了VIII因子的抑制剂，患者开始使用艾米珠单抗治疗。该F8内含子22倒置，“通常会引发一种严重的疾病”，有大约30％的机会发展同种免疫抑制剂，他补充说。     古德温医生继续治疗该患者，该患者现年10岁，他从州外徒步旅行时跌落在岩石上，并前往急诊科治疗超过四个小时的严重血肿。古德温（Goodwin）博士要求会议观看者选择艾米珠单抗对急诊医师下令进行的一系列凝血测试的正确影响：     APTT：错误地高估了。   APTT凝血因子VIII活性：错误地增加了活性。   PT：错误地低估了。   凝血酶时间：错误地高估了。   纤维蛋白原Clauss法：错误地低估了。     APTT不会错误地高估；他说，这将错误地低估了血凝时间。“因此，您将进行基于APTT血块的测定，由于APTT缩短，将导致活性错误增加。PT通常不受影响，凝血酶时间和纤维蛋白原克劳斯方法也不受影响。”     在这种情况下，基于APTT的凝血因子VIII活性测定结果会显示由于APTT缩短而活性升高。     在另一种情况下，一名14岁的男性因左膝关节肿胀而入院接受血液学咨询，被确定为患有关节病。进行实验室测试的结果如下：49秒时的APTT延长，11.2秒时的PT正常以及VIII因子活性（人试剂显色分析）都非常低，不到1％。进行Bethesda分析（显色，牛），结果为5.2 Bethesda单位（参考区间：零至VIII因子）。     根据结果，Unold博士询问以下哪一项是正确的：     由于文献缺乏中和抗体的记录病例，该患者尚未开发出抗艾米珠单抗的抗体。     显色的FVIII活性（人）对艾米珠单抗的存在不敏感。     检测到的贝塞斯达单位不正确。     APTT和PT结果均准确。     基于FVIII PTT血凝块的活性测定最适合评估患者的VIII因子活性。     答案：APTT和PT结果都是准确的。     Unold博士说：“知道艾米珠单抗会影响人为基础的显色活性，因此这种血友病患者中的VIII因子不到百分之一。” “我们希望使用艾米珠单抗，因为该测试受到了影响，我们实际上会虚假地增加了VIII因子的活性。但是在这种情况下，因为少于1％，我们认为艾米珠单抗未被考虑或未影响测定。”     导致该结果的两个原因可能是患者未遵从药物治疗或产生了抗艾米珠单抗抗体的中和抗体。     Unold博士说：“知道该药物不会影响测试，因此我们推测APTT实际上是准确的，不会被该药物错误地升高。” PT通常不受艾米珠单抗的影响，尽管这取决于所执行的PT。“在这种情况下，检测到的贝塞斯达单位将是准确的，当然是因为预计牛成分试剂测定法不会受到该药物的影响，更不用说该药物似乎不存在或不会影响这种基于人体的测试的事实了。”     他说，文献中有一些实例（HAVEN试验）表明中和抗体可以开发成艾米珠单抗。“并且请记住，如果患者使用艾米珠单抗，基于APTT凝块的测定不是评估患者VIII因子活性的最佳方法，因为这些基于凝块的测定会受到药物存在的影响。”     艾米•卡彭特•阿基诺（Amy Carpenter Aquino）是《CAP TODAY》的高级编辑。     文章来源于：https://www.captodayonline.com/     -En