RNA病毒扩拉检测的质控品和标准品研究进展

　　李金明

　　RNA病毒如丙型肝炎病毒（HCV）、人免疫缺陷病毒（HIV）、严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）等的核酸检测对于感染的早期诊断和抗病毒治疗疗效的动态观察具有重要价值。自1983年发明聚合酶链反应（PCR）技术以来，出现了基因扩增的概念。目前多采用核酸扩增技术（NAT）检测病毒RNA，最常用的是逆转录（RT）-PCR方法。核酸扩增检测想到可靠的结果，必须使用质控品进行严格的质量控制，而对病毒进行定量测定，通常还需须有病毒RNA标准品。目前RNA病毒扩增检测的质控品的标准品分为两大类，一是裸露的RNA片段，二是内含特定RNA的病毒样颗粒或称之为带盔甲的RNA（armored RNA）。
　　一、 裸露的RNA
　　裸露的RNA即没有任何蛋白包裹的RNA片段。其通常将特定的RNA病毒拟扩增RNA的cDNA经体外转录方式进行构建后，得到1种与相应cDNA互补的RNA（cRNA）。cRNA的构建方法基本上是首先将所需的RNA逆转录为cDNA，再经PCR 扩散后，产物DNA片段经T载体克隆人相应的质粒载体，然后再构建人含T7启动子的载体，体外逆转录得到相应的cRNA[1-5]。这种裸露的RNA即可作为相应RNA RT-PCR测定的质控品和定量标准品。
　　裸露的RNA构建方法简单，可在吸光度260nm波长下比色进行准确定量。其缺点是：（1）稳定性差，能于保存[1-3]。cRNA片段完全暴露于外界环境中，很容易被环境中的核糖核酸酶（RNase）所降解。（2）cRNA由相应模板DNA逆转录产生，原有模板DNA的污染很难通过加DNase消化去除[5]。（3）不能监测样本中的RNA病毒颗粒的裂解效率。cRNA直接暴露于样本溶液中，无法模拟和监测真正病毒颗粒的核酸提取过程[1-5]。由于上述原因，cRNA质控品和标准品很难在临床RNA病毒RT-PCR检测中实际应用，目前仅限于一些文献报道[1-5]。
　　二、 内含特定RNA的病毒样颗粒
　　已知某些RNA病毒如MS2噬菌体、烟草花叶病毒（TMV）的外壳可以耐受RNase的作用，因此，如将特定的RNA序列包裹到这些病毒外壳内，就可以使其免受环境中RNase的降解。同时，在应用过程中还可以模拟病毒颗粒监测核酸提取过程中的病毒裂解效率。
　　1． 包裹于MS2噬菌体包膜蛋白内的RNA
　　MS2呼噬菌体属于正极性单链RNA球形病毒，基因组全长3659bp，有编码成熟酶蛋白、包膜蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白等4种蛋白质分子。噬菌体由180包膜蛋白单体、一分子成熟酶蛋白和一分子基因组RNA组成，在较早期的大肠杆菌病毒—MS2噬菌体包膜蛋白的研究中，发现包膜蛋白与操纵子RNA序列有特异性相互作用，这种作用可在引发噬菌体外壳组装的同时，将噬菌体基因组RNA包装到包膜内。因此，如果将特定病毒RNA的cDAN克隆地MS2噬菌体包膜蛋白基因序列cDAN下游，并在其下游插入终止子，转录后得到带有噬菌体操纵子RNA序列的特定病毒RNA转录本，随后操纵子RNA序列就可以引发噬菌体包膜蛋白组装外壳，并将携带有特定病毒RNA序列的部分噬菌体基因组包装到包膜内，构成噬菌体病毒样颗粒。
　　要构建质粒表达载体时，需将噬菌体成熟酶蛋白、包膜蛋白基因序列cDNA克隆表达于表达载体启动子下游，经诱导表达后，所表达的包膜蛋白不仅可用为病毒样颗粒的结构万分，还可作为基因表达调节因子和pac信号对表达过程进行调节，使包膜蛋白的表达和RNA转录协调一致，组装所得噬菌体样颗粒有成熟特性，从而具有RNase抗性[6，7]。
　　国外及我们的研究[8-13]将编码MS2噬菌体相应蛋白的cDNA序列连接到表达载体，如Pet28b T7 启动子下游，经过诱导表达得到成熟酶蛋白和包膜蛋白，在成熟酶以及噬菌体基因组RNA片段的协同作用下，组装得到耐RNase的特性[12]。我们将HCV RNA[13]、HIV RNA和SARS-CoV RNA等的cDNA序列构建于该质粒载体中的MS2噬菌体19000基因组下游，经转化细菌表达后，即可得到具有耐RNase特性的内含特定RNA的病毒样颗粒。目前，我们还完成了构建肿瘤标志物，如前列腺特异抗原（PSA）和甲胎蛋白（AFP）的mRNA病毒样颗粒的表达载体，由于p1NCCL表达载体的通用性，可以预见其在涉及RNA标准品和质控品的研制中将具有极为广阔的应用前景。
　　2． 包裹于烟草花叶病毒（TMV）包膜蛋白内的RNA
　　将特定的病毒RNA序列的cDAN与烟草花叶病毒（TMV）的包膜基因序列cDAN一起克隆接到表达载体，也可诱导表达包膜蛋白并组装成病毒颗粒[14]。在诱导表达过程中，外源基因表达产物可随同组装的TMV颗粒一起组成，又要注意引入外源基因序列的位点，这样可以确保病毒基因组引起包膜蛋白的组装，并使组装的颗粒具有成熟特笥，即RNase抗性，同时，应确保引入的外源基因序列不会在重组过程中发生丢失现象。
使用内含特定RNA的病毒样颗粒或带盔甲的RNA做为RNA病毒RT-PCR检测的质控品的标准品，具有下述优点：（1）无生物传染危险性。（2）作为RNA RT-PCR检测的标准品和质控品具有很好的稳定性。（3）在核酸提取中，对病原体内RNA有很好的模拟作用。由于表达产物为噬菌体样颗粒，具有很好的病毒颗粒模拟功能。因此，在核酸提取过程中，与标本中真正病毒核酸的提取过程有很好的相似性。
　　此外，也有人应用牛腹泻病毒（BVDV）作为检测HCV的内部标准品[15]，或者用HCV病毒颗粒作为检测HCV RNA的标准品代替世界卫生组织提供的HCV标准品[16]，或者用HIV病毒颗粒作为通用的病毒RNA标准品，但是，这些技术无法克服病毒颗粒传染性、病毒颗粒制备、运输困难等问题，也就是说病毒颗粒不是理想的标准品。
　　综上所述，在RNA病毒RT-PCR检测中，影响试验过程的因素较多，如实验人员测定操作中的随机误差、扩增仪孔间温度的差异、标本核酸提取后抑制物的残留、待扩增靶核酸的浓度、逆转录的效率及试剂的问题等，这些因素均可能会影响PCR扩增的效率，进而造成结果的偏差。因此，PCR测定必须使用质控品进行严格的室内质量控制才能保证结果的可靠性，此外，进行定量测定，必须有定量的标准品或内标，内标还可起到单管即时质控的作用。一个稳定可靠，且无生物传染危险性的RNA质控品和标准品，对于保证RNA病毒的RT-PCR检测质量具有重要意义。在这一点上，裸露的RNA病毒颗粒及病毒替代品均难以作为理想的质控品的标准品，而采用分子克隆和原核表达方法构建的内含特定病毒RNA片段的噬菌体病毒颗粒则能较好的解决这些问题，其不但对于RNA病毒RT-PCR检测的标准化，而且对于特定的mRNA的检测等均有着潜在的应用价值。

摘自：《中华检验医学杂志》2004年12月第27卷第12期